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说起三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)大家都不陌生，它是砒霜中的主要成分，早在李时珍所著的《本草纲目》中便有记载：砒霜主治中风痰壅，疟疾以及项上瘰疬。

砒霜不仅仅在中国古代有使用，在近代西方国家中也有使用。比较有名的记载是十八世纪二十年代英国人托马斯·弗勒发明的弗勒溶液，其后来也被收入到英国药典和美国药典中。

但是砷具有强烈的毒性，1903年英国制造啤酒过程中由于原料砷污染，导致6000人中毒70人死亡，1928年法国有4万人由于面包和酒砷污染而中毒，1955年日本森永奶粉公司的配方生产过程中砷污染导致12131名新生儿中毒，130人死亡，等等。这一系列砷中毒事件使得砷剂的研究一度陷入低潮，直到2001年陈竺教授发表的文章——Arsenic trioxide, a therapeutic agent for APL. 才将砒霜从谷底捞出。

然而，三氧化二砷ATO治疗白血病的疗效在实体瘤中却不能复制，经研究发现主要原因是实体瘤细胞自噬水平较高，其与凋亡形成拮抗，阻碍实体瘤进入程序性死亡。那么是否可以通过抑制实体瘤自噬，使得ATO促凋亡作中占主导，最终使天平向凋亡倾斜？

2018年10月9日发表在Nature Communications上，IF：11.978，通讯作者：樊春海，单位：上海交通大学化学化工学院

1.纳米金刚石是一种十分强效的自噬抑制剂

多种纳米粒子表现出不同的细胞自噬抑制作用，为了找到一个安全有效的纳米粒子抑制剂，作者选用HepG2细胞检测了纳米金(AuNPs)、纳米三氧化二铁和四氧化三铁、纳米金刚石(NDs)等各种纳米粒子的自噬抑制作用。结果发现NDs、AuNPs和纳米四氧化三铁增加LC3-Ⅱ的积累，以及自噬底物p62（图1a）。为了进一步评估这些纳米粒子的自噬抑制作用，作者用shRNA靶向作用于ATG5，ATG7。ATG5/7缺失减少了NP诱导的LC3转化。免疫荧光结果也显示传统自噬抑制剂——氯喹CQ处理后导致黄色标记的LC3斑点增多。而NDs组红色标记的LC3斑点（mCherry阳性，GFP荧光阴性的自溶酶体）增加，这表明干扰了溶酶体清除（图1b）。因此，NDs与CQ有着不同的自噬抑制机制。CQ+NDs与NDs相比，LC3-Ⅱ增加，并且p62积累也增加，这进一步证实了NDs起到自噬抑制作用，以调节自噬通量和自体溶酶体通量（图1c）。综上，证实了NDs在细胞中的自噬抑制作用。并且进一步揭示NDs与CQ有着不同的自噬抑制机制，二者联合应用可以提高自噬抑制作用。作者接下来探索NPS是否能够影响ATO介导的HepG2凋亡。NDs和AuNPS增加了ATO介导的细胞凋亡，另外，ATG5/7缺失减少了NDs介导的ATO诱导的细胞凋亡（图1d）。在确定了NDs的自噬抑制作用后，作者进一步探究其在自体吞噬体加工过程中的机制作用。结果发现NDs处理导致NUPR1水平呈时间依赖性降低（图1e）。另外，ATG5/7缺失显著性地减轻了NDs引起的NUPR1耗竭。综上，证明了NDs通过损害细胞中NUPR1介导的自溶酶体渗透而起到自噬抑制剂的作用。

图1

2.ATO处理的HepG2自噬抑制的机制分析

作者接下来研究自噬抑制在ATO处理的HepG2细胞凋亡增强中的分子机制。

CQ+ATO联合处理HepG2可以增强细胞毒性，相反，NB4（急性早幼粒细胞白血病细胞系，自噬水平低）与CQ和ATO联合应用处理并没显示出明显的细胞凋亡，这样表明自噬在ATO处理的APL细胞中不起作用（图2a、b）。

在证实了自噬抑制在HepG2中基于ATO的细胞毒性中起到重要作用后，作者进一步探索NDs如何影响ATO治疗的HepG2。与CQ相似，当NDs添加到ATO处理的HepG2细胞中后，WB结果显示LC-Ⅱ累计的增加以及p62降解的抑制（图2c）。共聚焦结果进一步证明NDs的共处理显著减少由ATO诱导的LC3小点的形成，同时增加了细胞中的LC3阳性点装结构的积累。（图2e）TEM成像结果显示共处理可以显著性减少ATO诱导的自噬体形成，并且诱导含有NDs的自溶体的积累。（图2e）另外，共处理好观察到细胞内存在许多液泡，并伴随着caspase-3活性的增加（图2e）。

图2

3.NDs作为自噬抑制剂可以提高基于ATO的体内治疗疗效

为了评估NDs在基于ATO治疗中疗效，作者进行了一系列的体内外实验，从而评估NDs/ATO组合的治疗的安全性。NDs组相比于CQ组，血液中的各项指标较为稳定，且基本处于正常范围内（图3a）。在原位瘤模型中，NDs/ATO的血液循环曲线几乎每天保持恒定，并且每次给药后1/24h内从血液中清除（图3b）。此外，作者也检测它们的体内生物分布和清除率，在给药48小时后，NDs荧光信号显示NDs主要分布在肿瘤体，肝脏和肾脏中（图3c）。定量分析结果也显示NDs在脾和肺中累积，而ATO主要分布在肿瘤体，心脏，肝，脾，肺和肾（图3d）。绝大多数的NDs的累积在72小时后被清除了，而这个时间点又正好是下一次给药的时间点（图3d）。在证明NDs/ATO联合治疗疗法的突出生物相容性和肿瘤靶向性，作者进一步探讨NDs自噬抑制剂是否可以改善体内基于ATO的疗法。与NS组相比，首次给药后第91天，NDs/ATO组合将肿瘤重量降低至～33%，而单独使用NDs或者ATO（0.75mgkg-1）的治疗并没有显著影响肿瘤重量。对于1.5mgkg-1ATO组别，添加NDs可以将肿瘤重量从67%降低至9%，表明具有协同抗肿瘤作用（图4a，b）。另外，NDs/ATO组合可以降低肝脏肿瘤相关症状，如黄疸，肝腹水，以及肝硬化（图5a）。作者接下来探讨了治疗小鼠的存活率和健康状况。在NDs与高剂量ATO共同治疗的组中，小鼠存活150天以上。而与阴性对照组相比，单独使用不同剂量的ATO治疗只能提供有限的生存天数（图4e）。阴性对照组或ATO治疗组中的所有小鼠都死于疾病，实现长期生存的比例低于30%。此外，组织学分析，体重曲线和主要器官的系数表明，联合治疗方案没有明确的副作用（图4f，5b）。

图3

4.NDs+ATO短期和长期治疗的研究

为了进一步比较NDs+ATO与ATO治疗的短期与长期内肿瘤重量，肝损伤相关血清生化指标，作者选择给药后35天和91天作为短期与长期的天数。结果表明NDs+ATO联合治疗组的肿瘤比重随时间降低，而ATO治疗组肿瘤的重量比随时间没有明显变化（图5c）。

更有趣的是，NDs-ATO联合治疗组中的所有生化参数在35天时或多或少增加，最终恢复到正常小鼠91天时观察到的范围。相比之下，ATO治疗组中的这些参数随时间显着增加（图5d）。此外，NDs+ATO比CQ+ATO具有更高的治疗效果。首次给药后第91天进行肿瘤重量比分析，发现NDs+ATO可将肿瘤重量减少约91%，而CQ+ATO仅为～58%（图4b）。CQ之所以疗效较低原因可能是肿瘤微环境pH值较低，阻碍CQ发挥抑制自噬作用。

图4

5.NDs API增强肝癌ATO治疗的分子机制的探索

作者认为，NDs+ATO联合治疗的安全性和有效性来源于对器官的自噬特异性抑制。将荷瘤小鼠进行了LC2Ⅱ和ATG13进行免疫染色，结果发现，接受治疗的小鼠显示出明显的LC3Ⅱ和ATG13斑点，尤其是在肿瘤内部和周围血管的周围（图4g）。因此，作者确证了NDs+ATO联合治疗后肿瘤中自噬通量的调节。WB和TEM结果均证实NDs有抑制肝癌细胞组织中ATO诱导的自噬（图4c，6a）。TEM分析肿瘤结果也表明NDs在肿瘤部位的累积是由于增强的渗透性和保留效果（图6a）。

图6

总结

砒霜，我国的一味传统的中药，具有良好的治疗白血病的功效，但是对于实体瘤的治疗却一直没有很好的效果。这篇文章通过对比APL与HepG2细胞之间的差异——自噬水平不同，从而提出科学家说——能否通过抑制实体瘤细胞自噬从而提高ATO对实体瘤发挥促凋亡作用？并且作者通过一系列的实验证明了这个科学假说，扩大了ATO临床上抗肿瘤的范围，具有较高的临床价值。但是，这其中的分子机理还可以做进一步探索。